张丽, 杨东旭, 孔小平, 李璇儿, 韩诺, 刘玉梅, 韩风庆, 严湘萍, 张晓梅, 李占省, 徐进
为建立并优化不同基因型青花菜原生质体高效分化再生体系，为后续基因编辑、体细胞杂交等生物技术育种提供技术支撑，主要以青花菜B1、B16 两个基因型的子叶、真叶及下胚轴为试验材料，系统探究了酶解体系、预处理时间及渗透压条件对原生质体分离效果的影响，并优化了其分化再生关键参数。采用单因素试验设计，筛选纤维素酶与果胶酶的最优浓度组合；设置12～48 h 梯度预处理时间，分析不同组织材料的适配性；以甘露醇为渗透压稳定剂，优化酶解液与纯化缓冲液（W5）的适宜浓度；通过原生质体培养、愈伤组织诱导及分化培养，构建完整再生流程。结果表明：青花菜原生质体分离的最优酶解体系为0.8%（m/V）纤维素酶（celluase R-10）+ 0.1%（m/V）果胶酶（pectolyase Y-23），酶解13 h 可实现叶片完全酶解；不同组织材料的最佳预处理时间存在差异，子叶为24～48 h，真叶为12～24 h，下胚轴为48 h，此条件下原生质体产量可达144 × 105～195 × 105 个 · g-1（FW），活力维持在91.5%～96.9%；渗透压适配性分析显示，子叶原生质体最适酶解液甘露醇浓度为0.5 mol · L-1，配套纯化缓冲液为0 mol · L-1 甘露醇W5 溶液，真叶则需更高渗透压，最适酶解液与纯化缓冲液甘露醇浓度分别为0.7 和0.2 mol · L-1。优化后的体系可高效获得高产量、高活力的青花菜原生质体，且经培养可成功诱导愈伤组织形成并完成分化再生，不同基因型间再生效率存在一定差异但均表现稳定。本研究建立的青花菜原生质体分化再生体系具有较强的实用性与可靠性，为青花菜分子育种及基因功能研究提供了重要技术保障。
